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团员物的拓扑结构在决定其基因传递遵守方面起着关键作用。因此，探索新的团员物结构看成基因传递载体具有抨击的意旨。安徽理工大学/齐柏林大学王文新西宾团队初度通过门道助长团员症衔尾成了具有独有拓扑结构的新一代多环聚（β-氨基酯）s（CPAEs）。通过放弃环化的发生阶段，取得了三种不同大小和拓扑结构的环的CPAEs。体外实践标明，与具有大环的基因比较，具有大环的CPAEs（MCPAEs）权臣提升了转基因的抒发。此外，具有优化终局基团的MCPAE载体灵验地传递了编码金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶和双辅导sgRNAs的CRISPR质粒，用于基因裁剪颐养。关系规划恶果以“3D Macrocyclic Structure Boosted Gene Delivery: Multi-Cyclic Poly(β-Amino Ester)s from Step Growth Polymerization”为题于2023年7月25日发表在《Journal of the American Chemical Society》。

在本规划中，诈欺充分规划的季戊四醇四丙烯酸酯（PTTA）和5-氨基1-戊醇（S5）看成主单体（暗示图1A），缱绻了三种门道式助长团员（SGP）战略来颐养三种不同环结构合成CPAEs的成环能源学（决策1B−D）。

暗示图1 由不同的SGP要害产生的三种类型的CAPEs的化学结构和酿成机理的暗示图

【合成尺寸环CPAEs的SGP战略】

环化历程的进展如图1A、B所示。当团员物分子量（MW）接近二聚体时，63%的乙烯基被蹂躏，1h内的GPC陈迹如图1A、图1B红色虚线所示）。这个反应进度远远高于表面二聚体假定莫得环化反应44%的其他两种要害（图1C、F），标明在要害1中，在早期通过环化蹂躏了更多的乙烯基。跟着团员物链的助长，取得了具有不同尺寸的环（跟着团员历程的进行而冉冉增大）的CPAEs（称为SMCPAE）。上述团员历程如图1D所示。只好两个相距较远的官能团偶然通过构象变化相互战争和反应，从而产生宏不雅环（称为MCPAE）。通过该要害，取得了CPAE-3进行表征（图1E中的2.5h）。

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图1 比较三种不同的SGP战略在三种CPAEs酿成历程中的团员行为

【CPAE-1、CPAE-2和CPAE-3的结构表征】

聚簇触发辐射（CTE）的机制标明，CPAEs/HPAE中氧/氮原子之间的间距小于其范德瓦尔斯半径之和，导致灵验的电子相互作用，导致非共价键的空间离域，延长灵验共轭距离（图2D）。当在一张图像中不雅察三个CPAEs的PL图时，不错不雅察到它们的荧光行为之间的显豁区别，从CPAE-1到CPAE-3不错不雅察到越来越权臣的红移峰（图2E）。跟着环尺寸的增大，更多的孤电子对基团将固定在更密集的环结构中，剖释出更多的红移辐射（图2F）。因此，与CPAE-2和-3比较，CPAE-1（由要害1制备）的小环结构不错通过ca325nm处的主要荧光峰来反应出来（图2A、F）。而在CPAE-2中也存在多半的中型环，这标明在ca430nm处出现了一个长波长的荧光峰（图2B、F）。关于CPAE-3C，它在ca450 nm处剖释出一个主要的长波长辐射峰，确认了宏不雅环在其轮回结构中占主导地位（图2C、F）。

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CPAE-1到CPAE-3的1H−1H关系光谱（COSY）光谱默契，CPAE-1和CPAE-2上的g（Hg）质子与E7上的b（Hb）质子耦合（图3A），这意味着CPAE-1和CPAE-2的终局基团和骨干之间有很强的空间相互作用（图3B）。总关系光谱（TOCSY）默契了在CPAE-1和CPAE-2中，Hb（E7）和Hg（S5）上的改动耦合峰；关系词，在CPAE-3的相应区域莫得不雅察到这种相互作用（图3C）。这些收尾标明，CPAE-1和CPAE-2的大部分终局基团镶嵌在CPAE骨干中，而以大环为主的CPAE-3，其大部分终局基团向外蔓延，因此莫得不雅察到与骨干结构的相互作用。

图2 三种CPAEs的不同荧光景况偏激作用机制

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图3 CPAE-1到CPAE-3的2D-核磁共振谱

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【大环结构促进的基因转染】

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与CPAE-1、CPAE-2和HPAE比较，团员物/DNAw/w为120：1的CPAE-3在HEK细胞中的转基因抒发离别提升了21倍、18倍和138倍（图4A）。此外，即使在最高的团员物/DNA分量比（w/w = 200：1）下，统统细胞系中也莫得不雅察到细胞毒性（逾越90%的细胞活力）（图4B、D、E）。

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PicoGreen检测收尾默契，统统PAEs的DNA规划遵守均达到80%以上（图5A）。诚然不同的PAEs的DNA规划遵守雷同，把柄动态光散射（DLS）评估，暂停的轮回结构权臣匡助浓缩复合大小比较分支结构同期保执高zeta后劲（图5B、C）。此外，CPAE多聚物的尺寸跟着相应团员物的环尺寸的加多而减小（图5C）。不同PAEs酿成的多聚体大小的变化标明CPAEs的DNA缩合才气更强，格外是MCPAE。接下来还规划了不同PAEs的多聚体的CTE行为（图5D−F）。与PAE团员物的荧光比较，其多聚物的荧光齐裁减了（图5D−F）。这些发现标明，环状结构，格外是宏不雅环状结构（MCPAE），更有意于纳米级复合体的酿成。把柄Cy3象征DNA的荧光信号，不错看到细胞内对宏环CPAE-3的招揽远远逾越其他PAEs；在处置4h后，它是SCPAE（CPAE-1）和HPAE-1的4倍以上（图5G）。由于MCPAE核的强度更强，CPAE-3在醋酸钠溶液中的降解速率比其他PAEs要慢得多（图5H）。由于MCPAE的结构更踏实，基于CPAE-3的多聚体剖释出最慢的开释速率，在酸性条目下剖释出其最好的DNA保护才气（图5I）。

从图6A、B中不错看出，在保执80%以上的DNA包装遵守和高名义电位的同期，跟着宏不雅环化进度的加多，多聚体尺寸从MCPAE-0到MCPAE-72 h减少了70%。同期，从MCPAE-0到-72 h，复合体的招揽遵守提升了16倍以上（图6C）。转染MCPAE-72 h后的GFP抒发比MCPAE-0h增强了230倍，从分支结构过渡到大环结构，同期保执了逾越90%的细胞活力（图6D、E）。这些收尾进一步诠释了CPAEs中大环结构的掺入有意于DNA包装、细胞招揽、DNA保护以及最终的基因转染。

图4 体外评估不同轮回类型的CPAEs的基因转染性能

图5 转染关键阶段不同轮回型CPAEs的理化特征

图6 体外评价不同大环范畴（0~72h）的MCPAEs的基因转染性能

【高效MCPAE基因传递载体的设立偏激在基因颐养中的应用—终局优化】

基于要害3构建了隔断于不同终局含胺基团的MCPAEs，率先对不同碳链长度的低级氨基进行评估（图7A）。图7B中的转染收尾默契，跟着终局碳链的延长，隔断的MCPAEs的转染效果冉冉提升，并达到了终局基团C的最高性能。与HPAE-A到HPAE-D比较（图7C），MCPAE-A对MCPAE-D的转染性能要好得多，即使在最好HPAE/DNA w/w比（200：1）下，MCPAE-C也达到HPAE的4倍。MCPAE-G的GFP抒发量最高，逾越了统统生意药物（图7D）。且三种MCPAE险些莫得细胞毒性，默契了它们在高效和安全的基因颐养方面的后劲（图7E）。

图7 不同终局基团的MCPAEs和HPAEs的转染性能

【MCPAE介导的基因颐养隐性大疱性养分不良表皮松解症的体外评价】

报道称，由库珀自编自导自演的电影《音乐大师》是今年最受期待的电影之一，该片聚焦于美国传奇犹太作曲家、指挥家伦纳德·伯恩斯坦的人生故事，将于12月20日上线网飞。

颐养性基因传递的主要弊端是它们的大序列大小，如CRISPR-EXON80质粒（图8A）。图8B的收尾默契，与MCPAE-C和MCPAE-M比较，MCPAE-G在测试的团员物/DNA分量比范畴内（从80：1到200：1），在保执高细胞活力的同期，剖释出了更好的转染性能。因此遴荐了MCPAEG多聚体，并进一步应用于免疫细胞化学的Cas9的产生和定位规划（图8C）。在转染了CRISPR-EXON80质粒的HEK293细胞中，预期的裁剪条带模式很显豁，而在对照DNA中莫得不雅察到这种情况（图8D）。对Sanger测序收尾的CRISPR Edits（ICE）分析也确认了25%的DNA序列中存在58 bp的片断缺失（图8E）。

图8 MCPAE介导的体外基因裁剪评估

历史

【纪念】

本文提议了一种新的环化阶段放弃战略（要害1、要害2和要害3）来颐养不同SGP阶段的环化趋势。该战略偶然以可控的样式构建三种具有不同环尺寸和轮回拓扑结构的3D多轮回PAEs。三种CPAEs具有独有的拓扑特征（包括不同的环类型和端群散布等），并初度用荧光光谱法和2D-NMR法进行了考据。三种CPAE的基因转染收尾默契，与其他CPAE和HPAE比较，大环PAE（MCPAE）偏激多聚体权臣增强了DNA凝结、细胞招揽、DNA保护，从而提升了转染基因的抒发。剖释最好的MCPAE-C、-G和-M比最好的生意试剂Lipo 3000、jetPEI和Xfect具有更高的转染遵守。此外，诈欺优化终局基团的MCPAE，高效寄递编码金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶和双辅导sgRNAs的CRISPR-EXON80质粒，用于体外基因裁剪。本规划的发现为今后高效非病毒团员基因传递载体的发展提供了有价值的视力。

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c04191

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